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本试剂盒采用独特的组分，提取细胞及组∏织中的膜蛋白。特殊的溶液系统，在裂解细胞的同时，还可以选择性低地分离提取细胞膜蛋白与细胞器膜蛋白。提取方法简单，可靠，快速，获得的膜蛋白纯度高，可用于SDS-PAGE电泳、Western Blot、免疫沉淀等后续实验，每次可以提取10⁷个培养细胞或200mg动物组织。

储存和稳定性

 常温运输，收到后，DTT在-20℃保存，其余组分4℃保存，一年有效。

注意事项：

          需自备PMSF。PMSF要在抽提∞前2-3分々钟内加入，以免PMSF在水溶液中很快失效。

          浓缩洗涤液需要去离子水洗涤后再使用。

          使用本试剂盒抽提到的细胞核蛋白与细胞浆蛋☉白均可直接用GBCBIO的BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度或Lowry法测定▃蛋白浓度。

使用说明：

1．准备细胞或组织样品：

A． 细胞

贴壁细胞：培养约2000-5000万细胞，用PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞或用含↘有EDTA但不含胰酶的细胞消化液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，吸除上清，留下细胞沉淀备∩用。尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的膜蛋白。

悬浮细胞：培养约2000-5000万细胞，直接离心收◣集细胞，吸除上清，留下细胞沉淀备用。

B. 对于组织：

取约100毫克组织，用剪刀尽量小心剪切成细小的组织碎片

2．样品洗涤：用适量的已稀释的洗涤液洗涤样品三次，每次3000rpm离心2min。

3．样品裂解：在上述ζ细胞或组织中加入1ml蛋白提取液♀（使用前加入PMSF，终浓度为1mM，与2.5μl DTT），4℃下用玻∞璃匀浆器手动上下手动匀浆30-50次。或者用  超声波破碎细胞，每次30s，3-4次，每次间隔1分钟，置于ω　冰上冷却。细胞破碎后应经镜检，细胞破碎率不小于70%，无明显的组织』块。

镜检：通常可以在匀浆30次后取约2-3微升细胞或组织匀浆液滴在盖玻片上并在显微镜下观察，如见细胞核周晕环(A shiny ring around the nuclei)或完≡整的细胞形态，说明细胞仍完整。如果有70-80%的细胞均无核周晕环和完整细胞形态，说明细胞已」经充分破碎，则进◥行下一步实验。否则，重新匀浆10-30次直到细胞至少70%已经破碎。同时㊣　记录对于该细胞的匀浆次数，通常在后续实验时不必再摸索匀浆次数。另外需注意特定▆的匀浆次数和匀浆器也有关，需同时注意记录使用的是哪一个匀浆器。

    注：如果没有适当的玻璃匀浆器，对于培养的细胞＠也可以采用冻融法来破碎〒细胞。把步骤2中的样品在液氮和室温依次反复冻融两次，然后取少量样品在显微镜①下检测细胞破碎的程度。如果细胞破＠ 碎的程度不足70%，可增加冻融次数，直到细胞破碎的程度大于70%。

4. 转移裂解液到预冷的1.5ml离心管中，冰上放置10分钟，期◆间剧烈涡旋2-3次，于4℃，16000rpm离心10min，弃沉淀，上清移至新的离心管中。

5.含上清的离心管37℃水浴10min，室温，13000rpm离心5分钟，样品分成上层与下层（含膜蛋白）。

建议使用进口的透明度高的离心管，方便观察分层，在分层交界处有一折光线，需仔细观察才可〇以见到。

6.  取下层，加入500ul冰冷灭菌水混匀，4℃放置5min后，置于37℃水浴10min。

7.  室温，13000rpm离心5分钟，样品分成上层与下层（含膜蛋白）。

8. 重复第6,7步操作一次，最终取下层即为膜蛋白提取※物。BCA法测定蛋白浓度。

9. 每100ul膜蛋白提取物加入900ul预冷的丙酮，混匀冰浴20min，16000rpm离心15min。

10. 弃上清，沉淀真空干燥或敞盖冰▼浴10min，用含巯基乙醇或DTT适量的loading buffer溶解沉淀。如沉淀难以溶解，可以加入尿素或硫脲等强溶解力试剂。